Physical Address
304 North Cardinal St.
Dorchester Center, MA 02124
Definitie van de laboratoriumtechniek
Immunohistochemie, ook wel IHC genoemd, is een techniek die wetenschappers in een laboratorium gebruiken om zogenaamde antigenen in weefselcoupes op te sporen. Ze gebruiken hiervoor hulpstoffen, antilichamen genaamd. Deze antilichamen worden zichtbaar gemaakt met behulp van een hulpstof, een chromogeen. Dit creëert een kleur die onder een microscoop te zien is.
Klinisch nut en Patiëntenzorg
Immunohistochemie is van groot belang voor artsen bij het diagnosticeren van kanker en het achterhalen van de oorsprong van tumoren. Het helpt artsen ook bij het kiezen van de juiste behandeling door aan te tonen waar bepaalde eiwitten zich in de cellen bevinden. Dit is essentieel voor immunohistochemie, omdat het artsen helpt te begrijpen wat er precies gebeurt en hoe ze immunohistochemie kunnen inzetten om mensen te helpen.
Vergelijking met andere diagnostische methoden
Inzicht in immunohistochemie is essentieel voor het begrijpen van de wereld van de anatomische pathologie. Immunohistochemie verschilt van testen zoals flowcytometrie of moleculaire testen, omdat het daadwerkelijk naar het weefsel kijkt. Dit betekent dat immunohistochemie de weefselstructuur intact laat, waardoor pathologen kunnen zien waar een eiwit in een tumor of weefselmonster verschijnt. Deze handleiding beschrijft de stappen van immunohistochemie, de gebruikte markers en hoe de resultaten van immunohistochemische testen te interpreteren zijn.
Het kernprincipe: de binding tussen antigeen en antilichaam.
De analogie van het slot en de sleutel
Immunohistochemie (IHC) draait eigenlijk om hoe een antilichaam zich bindt aan een antigeen, een soort eiwit. Het antigeen is als een slot en het antilichaam is als een sleutel die in dat slot past. Wanneer de antilichaamsleutel in het antigeenslot past, krijg je een signaal dat je kunt zien. Het antilichaam en het antigeen vormen een paar en het antilichaam is zeer specifiek voor het antigeen, wat betekent dat het zich alleen daaraan bindt. Dit is wat IHC mogelijk maakt: het antilichaam en het antigeen, of de sleutel en het slot, komen samen om ons een signaal te geven.
Het belang van de primaire Antilichaam
Bij het uitvoeren van een kleuring is het primaire antilichaam erg belangrijk. Het kiezen van een willekeurig antilichaam kan problemen veroorzaken. Je kunt negatieve resultaten krijgen of de achtergrond kan volledig gekleurd raken, wat niet de bedoeling is. Dit kan de testresultaten onbruikbaar maken. Het primaire antilichaam is de sleutel tot een succesvolle IHC-kleuring.
De basisworkflow
Weefselpreparatie en -inbedding
Weefselpreparatie is een proces waarbij weefsel wordt gefixeerd in een vloeistof genaamd formaline en vervolgens wordt ingebed in paraffine, ook wel bekend als FFPE. Dit is een manier om het weefsel klaar te maken voor onderzoek. Het weefselpreparatieproces omvat het fixeren van het weefsel en het vervolgens inbedden ervan in paraffine.
Sectie- en schuifmontage
Het weefsel wordt in dunne plakjes gesneden, van ongeveer 4 tot 5 micron, en deze plakjes worden vervolgens op objectglaasjes gelegd. Dit wordt het snijden van weefsel genoemd. Het weefsel wordt gesneden zodat het van dichtbij bekeken kan worden.
Antigeenherstel en formalineherstel
Antigeenherstel is een proces waarbij warmte of speciale hulpmiddelen zoals enzymen worden gebruikt om antigenen weer zichtbaar te maken. Deze antigenen raken verborgen wanneer een preparaat wordt behandeld met formaline om het te conserveren. Door warmte of enzymen te gebruiken, worden de antigenen die door de formaline waren gemaskeerd, weer blootgelegd. Op deze manier helpt antigeenherstel ons om de verborgen antigenen te zien, wat belangrijk is voor verder onderzoek.
Primaire antilichaamincubatie
Bij incubatie met primaire antilichamen brengen we het primaire antilichaam aan, waarna het zich hecht aan hetgeen het zoekt, namelijk het doelantigeen. primaire antilichaam is zeer effectief in het vinden en binden aan het doelantigeen.
Het enzymgekoppelde detectiesysteem
detectiesysteem werkt als volgt: een speciaal hulp-antilichaam, gekoppeld aan een enzym zoals HRP, hecht zich aan het antilichaam. Dit hoofd-antilichaam noemen we het antilichaam. Het detectiesysteem gebruikt dit antilichaam om de taak uit te voeren.
Chromogeenontwikkeling en visualisatie
Chromogene ontwikkeling is een proces waarbij een enzym samenwerkt met een stof, zoals DAB, om een kleur te creëren die we kunnen zien. Het enzym en de stof, zoals DAB, reageren met elkaar om deze bruine kleur te produceren. Dit is wat er gebeurt bij chromogene ontwikkeling.
Soorten IHC-kleuringen
De juiste kleuringsmethode kiezen
Immunohistochemie, ofwel IHC, werkt niet in elke situatie hetzelfde. Wanneer artsen een vraag over de gezondheid van een patiënt proberen te beantwoorden, kiezen pathologen de kleuringstechniek waarvan ze denken dat die hen zal helpen het antwoord te vinden. Ze moeten kiezen uit verschillende soorten immunohistochemische kleuringen.
Kenmerken van directe immunohistochemie
Directe immunohistochemie, ofwel directe IHC, is een methode waarbij het primaire antilichaam rechtstreeks wordt gelabeld met een kleurstof, een zogenaamde fluorofoor, of met een enzym. Deze manier van directe IHC uitvoeren is sneller. Het is echter minder effectief in het vinden van wat we zoeken, waardoor het minder gevoelig is.
Indirecte IHC en signaalversterking
Indirecte IHC is de meest gebruikte methode. Hierbij wordt een antilichaam zonder label gebruikt. Dit primaire antilichaam wordt gevolgd door een antilichaam met een label. Het signaal wordt sterker doordat één primair antilichaam zich kan binden aan secundaire antilichamen. Dit maakt indirecte IHC gevoeliger. De indirecte IHC-methode is hierdoor zeer effectief in het detecteren van stoffen.
Multiplex IHC in oncologisch onderzoek
Multiplex IHC is een methode om meerdere stoffen tegelijk in een weefselmonster te detecteren. Dit wordt bereikt door kleuren te gebruiken om de locatie van verschillende antigenen aan te geven. Dit is met name nuttig bij onderzoek naar de werking van kanker, oftewel oncologie. Multiplex IHC wordt steeds belangrijker op dit gebied, omdat het ons helpt antigenen in één weefselcoupe te visualiseren.
Belangrijke indicatoren in de klinische praktijk
Het nut van specifieke antilichamen
De kracht van IHC schuilt vooral in de verzameling antilichamen. Wanneer artsen weefsels onderzoeken in de pathologie, gebruiken ze specifieke markers om specifieke kenmerken van het weefsel te achterhalen. Ze willen vragen beantwoorden en gebruiken daarvoor specifieke markers, zoals IHC. IHC is erg nuttig omdat het veel antilichamen bevat die artsen kunnen helpen de antwoorden te vinden die ze nodig hebben.
Epitheelcellen (carcinomen)
Cytokeratines (CK7, CK20) worden gebruikt om adenocarcinomen van verschillende oorsprong te onderscheiden (bijv. long versus dikke darm).
Long- en schildkliermarkers
Thyroid Recap Factor-1 (TTF-1) is specifiek voor lymfomen van de longen en de schildklier.
Mesenchymale labels (sarcomen)
Desmine duidt op spierisolatie.
Neuronale en vetweefselmarkers
S-100 wordt gebruikt voor carcinomen, neurale en vetweefselwoekeringen.
Hematopoëtische labels (lymfomen)
CD3 (T-cellen) en CD20 (B-cellen) zijn essentieel voor de classificatie van tuberculose.
Groei- en agressiemarkers
Ki-67 is een marker die aangeeft hoe snel cellen groeien. Een hoge Ki-67-waarde betekent dat de woekeringen zeer agressief zijn. De Ki-67-marker is belangrijk omdat deze ons helpt de ernst van de woekeringen te begrijpen. Als een woekering een Ki-67-positie heeft, is de kans groot dat het een ernstig probleem betreft. De Ki-67-positie wordt gebruikt om te bepalen hoe agressief de woekeringen zijn en welke behandeling nodig is.
IHC versus andere diagnostische methoden
Vergelijkende diagnostische bruikbaarheid
Om echt te begrijpen wat immunohistochemie (IHC) voor ons kan betekenen, is het nuttig om het te vergelijken met andere methoden die we doorgaans gebruiken om aandoeningen te diagnosticeren. We zouden IHC moeten vergelijken met individuele instrumenten die we dagelijks gebruiken. Dit zal ons helpen inzien hoe nuttig IHC werkelijk is.
Vergelijking van monstertype en technologie
Immunohistochemie (IHC), flowcytometrie, moleculaire testen (PCR/NGS)
Monstertype: Vaste doek (FFPE-blokken), vloeistof/suspensie (bloed, botweefsel), doek of vloeistof (DNA/RNA)
Het belang van ruimtelijke context
Een ruimtelijke omgeving is echt goed als deze het raamwerk behoudt.
Aan de andere kant is er geen sprake van een ruimtelijke omgeving wanneer cellen in een suspensie rondzweven.
Ook bij analyses van nucleïnezuren speelt de ruimtelijke omgeving geen rol.
Visualisatie van eiwitexpressie
Eiwitdetectie: Ja (directe visualisatie) Ja (oppervlakte en intracellulair) Nee (circulair via DNA/RNA)
Klinische toepassing en timing
Primair gebruik, subtypering, prognostische labels, immunofenotypering, celtellingen, mutatieopsporing, translocaties
Levertijd: 1-2 dagen, dezelfde dag. Levertijd: 3-10 dagen.
Interpretatie: De kunst en de wetenschap
Vaardigheden in pathologische evaluatie
Het interpreteren van IHC is een vaardigheid die kennis van het lichaam combineert met inzicht in de werking van antilichamen. Voor mij is het interpreteren van IHC de manier waarop je echt kunt zien of iemand er goed in is. Het interpreteren van IHC vereist veel oefening en kennis van het lichaam en antilichamen.
De „Allred Score“ en semikwantitatieve analyse
Beoordeling van complexe vlekken
Pathologen zeggen over het algemeen niet dat een aandoening simpelweg positief of negatief is. Ze gebruiken vaak scores die wat complexer zijn. De Allred-score, die bijvoorbeeld wordt gebruikt voor de classificatie van botkanker, combineert verschillende effecten.
Methodologie voor het berekenen van proportiescores
Hoe groot is de kans dat de cellen daadwerkelijk gekleurd zijn als je ernaar kijkt? Je moet een proportiescore van 0 tot 5 toekennen. Deze proportiescore is belangrijk omdat hij aangeeft hoeveel cellen gekleurd zijn. De proportiescore is als het ware een maatstaf voor hoe belangrijk de gekleurde cellen zijn.
- Je moet bedenken wat de kans is dat de cellen gekleurd zijn.
- Je geeft ook een proportiescore van 0 tot 5 op basis daarvan.
De proportiescore wordt gebruikt om te bepalen hoeveel cellen gekleurd zijn.
Het meten van de intensiteit van vlekken
Intensiteitsscore (0-3) Hoe sterk is de vlek (zwak, matig, sterk)?
Het bepalen van de klinische relevantie
De totale score bepaalt hoe belangrijk een criterium is in een bepaalde context, bijvoorbeeld of iemand ER-positief is of niet. De totale score is doorslaggevend bij het vaststellen van de significantie, zoals in het geval van ER-positiviteit.
Veelvoorkomende risico’s bij interpretatie
Vals-positieve resultaten en biotine-interferentie
Valse reacties kunnen voorkomen. Soms kan de biotine die van nature in ons lichaam aanwezig is, bijvoorbeeld in de lever, de detectiesystemen verstoren. Dit kan leiden tot ongewenste kleuringen. De biotine kan zich binden aan de detectiesystemen. Dit is de oorzaak van het probleem. De detectiesystemen raken in de war door de biotine in de lever. Daarom krijgen we valse reacties.
Vals-negatieve resultaten en slechte fixatie
Vals-negatieve resultaten: Als de handdoek niet goed is gefixeerd, kan dit de antigenen ernstig verstoren. Dit betekent dat als het eiwit waarnaar we zoeken daadwerkelijk aanwezig is, we mogelijk geen kleuring zien. Het eiwit is wel degelijk aanwezig in de handdoek. Door de slechte fixatie van de handdoek kan het lijken alsof het eiwit er niet is. Dit is een probleem, omdat het ons resultaten kan opleveren. We moeten daarom zorgvuldig te werk gaan bij het fixeren van de handdoek, zodat we het eiwit kunnen vinden als het er echt is.
Achtergrondkleuring en signaalverduistering
Achtergrondkleuring is een probleem omdat het wordt veroorzaakt door antilichamen die zich binden aan effecten waaraan ze zich niet zouden moeten binden. Dit kan het signaal dat we proberen te zien maskeren. Achtergrondkleuring treedt op wanneer antilichamen zich hechten aan de effecten, waardoor het moeilijk wordt om een duidelijk beeld te krijgen van wat er werkelijk met de antilichamen gebeurt.
De rol van IHC bij kankersubtypering
Bepaling van de oorsprong van de tumor
Immunohistochemie (IHC) is erg belangrijk om te bepalen welk type woekering iemand heeft, vooral wanneer de woekering er niet uitziet alsof hij tot een bepaalde groep behoort. Wanneer ombervissen een woekering onder een microscoop bekijken en deze er na een standaard H&E-kleuring uitziet als een hoop blauwe cellen, gebruiken ze IHC om precies te bepalen waar de woekering vandaan komt. IHC helpt ombervissen te ontdekken welk type IHC de woekering is, wat cruciaal is voor het bepalen van de behandeling, zowel voor de IHC als voor de woekering zelf.
Uitgezaaid longmelanoom
Ter illustratie: een uitgroei in de long zou bijvoorbeeld kunnen zijn
TTF-1 positief gemetastaseerd longmelanoom.
Uitgezaaid melanoom van de dikke darm
CDX-2-positief gemetastaseerd melanoom van de dikke darm.
Uitgezaaid niermelanoom
PAX-8-positief gemetastaseerd melanoom.
Implicaties voor behandelprotocollen
Het onderscheid tussen goederen maakt een verschil in hoe we ermee omgaan. We moeten vanwege dit onderscheid verschillende methoden gebruiken om het product te behandelen. De behandelprotocollen verschillen eveneens vanwege dit onderscheid.
Veelgestelde vragen
Het verschil tussen IHC en immunofluorescentie (IF)
Wat is het verschil tussen IHC en immunofluorescentie (IF)?
Chromogenen versus hulpmiddelen voor een stralende huid
Beide methoden maken gebruik van antilichamen. De eerste, IHC genaamd, gebruikt een coadjuvans dat een bruine of blauwe kleur produceert. Deze kleur kunnen we zien onder een microscoop met gewoon licht. Het andere systeem, IF genaamd, gebruikt antilichamen die in het donker oplichten. We hebben een microscoop nodig om deze antilichamen te kunnen zien, een microscoop die oplichtende effecten vertoont. IHC wordt over het algemeen gebruikt door artsen om te achterhalen wat er met iemand aan de hand is. IF wordt echter vaak gebruikt om meer te weten te komen over een product of om een specifiek soort handdoekmonster te onderzoeken.
Toepasbaarheid op verschillende weefsels
Immunohistochemie (IHC) kan worden uitgevoerd op verschillende soorten weefsel. IHC is namelijk een test waarbij antilichamen worden gebruikt om eiwitten in weefsel te vinden. IHC wordt over het algemeen uitgevoerd op weefsel dat uit het lichaam is verwijderd. Dit weefsel wordt behandeld met chemicaliën en in zeer dunne plakjes gesneden. Deze plakjes worden op een objectglas geplaatst. Aan het weefsel worden antilichamen toegevoegd om te zien of de eiwitten aanwezig zijn. IHC kan worden uitgevoerd op weefsel afkomstig van een vivisectie of van weefsel dat tijdens een operatie is verwijderd. Kortom, IHC kan worden uitgevoerd op verschillende soorten weefsel, waaronder weefsel van de huid, lever en andere organen.
Formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels
Dit werkt over het algemeen goed. Het werkt vooral goed op weefsel dat is gefixeerd met formaline en ingebed in paraffine, ook wel formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel of FFPE-weefsel genoemd. Men gebruikt ook bevroren weefsel, maar dat vereist speciale zorg bij de hantering. Soms kan een behandeling van botweefsel om calcium te verwijderen de antigenen beschadigen. Dat maakt het lastig om immunohistochemie (IHC) op het weefsel uit te voeren. IHC is echter nog steeds mogelijk, maar het is delicater wanneer het botweefsel is ontkalkt.
IHC-kleuringsduur
Hoe lang duurt een IHC-kleuring?
Doorlooptijd voor één monster
Het duurt doorgaans één tot twee dagen voordat de resultaten van een enkele kleuring op een monster zichtbaar zijn.
Complexe tijdlijnen voor meerdere kleuringen
Maar zelfs als ombervissen veel vlekken hebben, bijvoorbeeld tien tot twintig, kan het meerdere dagen duren voordat een uitgroei duidelijk wordt.
Controle op nauwkeurigheid
Dit geldt met name als de onderzoekers nog werk moeten verzetten om de nauwkeurigheid van de tests te garanderen.
Kwantitatief meetpotentieel
Is IHC kwantitatief?
Digitale pathologie en subjectieve analyse
Dit is niet volledig meetbaar. Digitale pathologie en beeldanalysesoftware proberen het nauwkeuriger te maken. Het menselijk oog blijft echter de meest elegante manier om te bepalen wat de vlek werkelijk betekent voor het betreffende geval. Het menselijk oog is wat we het meest vertrouwen als het gaat om het interpreteren van de vlek.
Beperkingen van IHC
Wat zijn de beperkingen van IHC?
Opsporing van genetische mutaties
Immunohistochemie (IHC) is op zichzelf niet geschikt om mutaties of translocaties op te sporen. Toch kan IHC ons wel aanwijzingen geven. Zo kan IHC bijvoorbeeld ALK-kleuring in longkanker detecteren. Voor een goede werking van IHC is een goed antilichaam nodig. Wanneer artsen de resultaten interpreteren, moeten ze hun eigen oordeel vellen, omdat er geen standaardregels zijn om te volgen.
Belangrijkste conclusies
Behoud van de ruimtelijke omgeving
Ruimtelijke omgeving Immunohistochemie, of kortweg IHC, is een manier om eiwitten in de handdoek te visualiseren. De structuur van de handdoek blijft intact, waardoor je kunt zien waar de eiwitten zich bevinden. Dit is essentieel om te begrijpen wat er in de handdoek gebeurt.
De pijlers van de diagnostische triade
De diagnostische triade is een van de drie pijlers van de pathologie, naast histologie (H&E-kleuring) en moleculaire testen.
Semi-kwantitatieve evaluatie
Semi-kwantitatieve resultaten worden op een bepaalde manier bekeken. Ze zijn gebaseerd op de mate waarin een product bevlekt is en hoe sterk de vlek is. Dit betekent dat semi-kwantitatieve resultaten niet simpelweg aangeven of een product positief of negatief is.
Betekenis bij het subtyperen van ziekten
Cruciaal voor subtypering. Essentieel voor het onderscheiden van lymfomen, sarcomen en tuberculose, en voor het bepalen van de oorsprong van metastatische klachten.
Het visualiseren van eiwit- en moleculaire identiteit
Immunohistochemie (IHC) overbrugt de kloof tussen het minuscule uiterlijk van een cel en zijn moleculaire identiteit. Door de eiwitexpressie in de weefselomgeving in beeld te brengen, biedt IHC pathologen de precieze gegevens die nodig zijn voor de diagnose van complexe aandoeningen en de bijbehorende onderbouwde behandelplannen. Naarmate de oncologie zich ontwikkelt richting doelgerichte therapieën, zal de rol van IHC bij het identificeren van therapeutische biomarkers alleen maar blijven groeien.
